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RNAi病毒包装及挑选

package virus



尝试道理


与化学分解的siRNA和shRNA质粒载体比拟,操纵慢病毒或腺病毒抒发shRNA,一方面可用于传染依托传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞,进步shRNA导入细胞的效力,另外一方面病毒介导可耽误RNAi的时候,特别慢病毒传染后能够整合到宿主细胞基因组,停止稳转挑选。

图2.4慢病毒介导RNAi道理表示图


手艺利用


手艺利用基因功效的体表里研讨

病理机制研讨


尝试流程




什物

数据信息

尝试周期

客户供给

靶细胞

目标基因NCBI登岸号,细胞培育信息

11-12周

咱们供给

RNAi载体/菌株 

根基尝试步骤,细胞照片,病毒包装尝试报告、RNAi挑选尝试报告


尝试功效展现


图 1 绝对定量 PCR 检测 3 组 shRNA 慢病毒传染组绝对阳性对比组目标基因的搅扰功效


TPOUBLESHOOTING


尝试题目

缘由

保举处置体例

搅扰病毒传染靶细胞后qPCR干扰功效不佳?

传染效力低

肯定细胞状况杰出;接纳适合的病毒MOI值,传染效力80%以上。

搅扰病毒传染后对细胞毒性较大?

靶基因的功效

阳性对比病毒若是对细胞毒性无影响则申明靶基因的功效对细胞的增值是必需的。

搅扰病毒传染后的稳转株构建失利?

靶基因的功效

若是阳性对比稳转株能够构建胜利申明靶基因的功效对细胞的增值是必需的。



罕见题目 FAQ


Q:化学分解siRNA,shRNA质粒和shRNA病毒停止细胞尝试的优错误谬误?

罕见的 RNAi 载体 / 体例

长处

错误谬误

化学分解 siRNA 转染细胞

化学分解便利快速,周期短。能够停止植物体内尝试研讨。

搅扰功效轻易遭到细胞转染效力影响;siRNA 很快被细胞外排扰功效坚持的时候不能跨越3天。

shRNA 质粒转染细胞

载体构建便利,能够停止扩增,防止了 RNA 操纵中的特别求,且质粒载体上能够带有EGFP 荧光标记和挑选标记。

良多肿瘤、原代细胞转染效率很低,不能获得很好的干扰功效。

shRNA病毒传染细胞

经由过程慢 / 腺病毒介导能够有用传染靶细胞 80% 以上,搅扰效果到达70% 以上。此中慢病毒介导的shRNA 能整合入靶细胞的基因组中,可停止不变株挑选任务。

病毒包装的用度绝对 siRNA 和shRNA 有所进步,包装周期要长 siRNA 分解及 shRNA 载体构建。


Q:我供给靶细胞为甚么需停止预尝试?需检测哪些内容?

A客户供给的靶细胞停止培育后肯定其状况,咱们会停止靶基因的抒发品貌检测,确认靶基因的抒发量,而后接纳慢病毒或腺病毒停止细胞的 MOI 值试探,确认靶细胞用何种病毒估计接纳多大的病毒量停止传染尝试。若预尝试功效标明细胞脱靶基因的本底抒发本身很低则不倡议停止搅扰挑选任务。


Q :病毒介导的RNAi挑选任务公司作何保障?

A:起首预尝试试探客户供给靶细胞的 MOI 值,传染效力到达 80% 以上,从而肯定病毒的包装范例。而后设想三个搅扰靶点并停止病毒包装任务,传染靶细胞后,咱们经由过程 qPCR 检测,确保最少一个靶点的搅扰功效大于80%。尝试竣事后最好搅扰靶点的腺病毒可按照客户的请求停止扩增;最好搅扰靶点的慢病毒能够按照客户的请求大批包装后供给给客户。


参考文献

1. Buchschacher GL Jr, Wong-staal F. Development of Lentiviral Vectors for Gene Therapy for Human Diseases.Blood2000,95(8):2499-2504.

 
 
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