锐赛生物

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酶联免疫吸附测定

ELISA



尝试道理


酶联免疫吸附剂测定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA),因此免疫学反映为根本,将抗原、抗体的特同性反映与酶对底物的高效催化感化相连系起来的一种敏理性很高的尝试手艺。根基道理是:1)使抗原或抗体连系到某种固相载体外表,并坚持其免疫活性。2)使抗原或抗体与某种酶毗连成酶标抗原或抗体,这类酶标抗原或抗体既保留其免疫活性,又保留酶的活性。因为酶的催化频次很高,故可缩小反映功效,从而使测定体例到达很高的敏感度。


在测按时,把受检标本(测定此中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按差别的步骤与固相载体外表的抗原或抗体起反映,再用洗濯的体例使固相载体上构成的抗原抗体复合物与其余物资分隔,最初连系在固相载体上的酶量与标本中受检物资的量成必然的比例。插手酶反映底物后,底物被酶催化为有色产品,产品的量与标本中受检物资的量间接相干,故可按照反映后色彩的深浅停止定性或定量阐发(见图4.7)。


图4.7 ELISA检测道理表示图


尝试流程


E流程.jpg



什物

数据信息

尝试周期

客户供给

样本、ELISA试剂盒

ELISA试剂盒申明书

2周及以上

咱们供给

残剩试剂盒

根基尝试步骤、EXCEL原始数据、规范曲线



尝试功效展现


功效.jpgConecntrations

图4.8ELISA规范曲线


表4.1五组样本目标卵白ELISA吸光度值及浓度



OD1

OD2

OD3

均匀值

C(pg/ml)

1

0.761

0.763

0.762

0.762

136.80

2

0.631

0.633

0.635

0.663

130.71

3

0.704

0.702

0.701

0.702

144.11

4

0.903

0.904

0.901

0.903

144.17

5

0.623

0.618

0.621

0.621

117.45



TROUBLESHOOTING


尝试题目

缘由

保举处置体例

尝试频频性不佳?

操纵频频性不佳

统一职员频频操纵,注重将样本充实混匀,保障加样量分歧,其余操纵进程如孵育时候,洗板前提坚持分歧。

加样孔显色过深?

洗濯不充实

充实洗濯,完全拍干。

加样时候太长

公道支配任务量,样本量多要节制好加样速率或分批操纵。

孵育温渡过高

接纳适合的温度。

孵育时候太长

注重削减孵育时候。

加样孔显色过浅?

试剂盒未充实均衡

4℃冰箱掏出试剂盒后于室温均衡至20分钟

洗板时打击力太大

注重调剂洗濯时候和洗濯次数。

底物感化时候缺乏

注重精确按时。

样本浓度浓缩过大

预尝试试探样本浓缩浓度。

加样孔包含规范品加样孔都未显色?

显色液过时

改换新的ELISA试剂盒

操纵毛病的试剂

漏加酶连系物或毛病的操纵停止液提早停止了反映。



罕见题目FAQ


Q:ELISA 试 剂 盒 主 要 有 哪 些 试 剂 ?

A:ELISA 试剂盒中首要有

1)已包被抗原或抗体的固相载体(免疫吸附剂);

2)酶标记的抗原或抗体(连系物);

3)酶的底物;

4)规范品

5)连系物及标本的浓缩液;

6)洗濯液;

7)酶反映停止液。

Q:构成ELISA尝试功效不普通的身分有哪些?

A:构成ELISA测定功效不普通的身分首要有:

1标本身分:样本需新颖收罗,防止净化,且精确浓缩至恰当的倍数。

2)试剂身分:ELISA试剂盒在保质期内,其余试剂如蒸馏水的水质等。

3)操纵身分:注重操纵细节,如加样不可太快,防止加在孔壁上;洗板进程中注重洗液不能溢出孔外;显色要注重节制时候等。


Q:若何筹办须要停止ELISA检测的细胞样本?

A:检测细胞排泄性成分时:用无菌管搜集细胞培育上清,离心20分钟(2000-3000转/ 分)

取上清检测。检测细胞内成分时:搜集细胞,用PBS(pH7.2-7.4)浓缩细胞浓度至 106/ml摆布,经由进程频频冻融或插手构造卵白萃取试剂,使细胞粉碎并放出细胞内成分。离心 20 分钟(2000-3000 转 / 分),搜集上清。保管进程中若有积淀构成,需再次离心。


Q:ELISA 试剂盒(96 孔规格)普通能够停止几多个样本的检测?

A:规范品孔和待测样本孔需停止复孔操纵以保障数据的可托度。每次需将规范品按照7-8个梯度浓缩以制备精确的规范曲线。一次96孔板尝试能够停止20-25个样本的检测任务。

Q:ELISA 的检测数据若何停止处置?

A:1)将获得的各个复孔浓度的吸光度值计较均匀值。

2)按照横坐标为梯度浓缩的规范品浓度,纵坐标为吸光度值做散点图,增加趋向线,操纵多项式回归阐发计较由以上数据产生的公式R2 值(R2 值越靠近1申明线性干系越好)。

3)按照公式及待测样本的均匀吸光度值计较样本中目标卵白的浓度。


Q:经常利用的免疫学检测体例ELISAWB的辨别有哪些


辨别名目

ELISA

WB

目标

不只能够检测抗原还能够检测抗体,对其停止定性和定量阐发。

定性阐发,对胶片灰度值停止半定量阐发。

抗体辨认位点

线性化或构象型位点都可。

线性化位点。

长处

96 孔板能够处置多个样本,经由进程设置复孔,对比,梯度可进步数据的可托度,且活络度高于WB

可明白卵白的份子量巨细,和是不是为多聚体或产生降解。

错误谬误

若是抗体有非特同性连系,获得的数值则不可托。

一次电泳最多处置10-20 个样本。


参考文献

1. J.R. Crowther. The ELISA Guidebook. Hunana Preaa,2001.

2. J.R. Crowther. ELISA:Theory and Practice.Humana Press,1995.

 
 
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