锐赛生物

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流式周期检测

Flow cycle detection



尝试道理


细胞周期(Cell Cycle)是指细胞从一次割裂实现起头到下一次割裂竣事所履历的全进程,细胞的遗传物资复制并均等地分派给两个仔细胞。细胞周期分为间期与割裂期两个阶段。间期又分为三期:即DNA分解前期(G1期)、DNA分解期(S期)与DNA分解前期(G2期)。某些细胞在割裂竣事后临时分开细胞周期,遏制细胞割裂,履行必然生物学功效(G0期)。

流式细胞仪PI染色法检测细胞周期的道理:因为细胞周期各时相的DNA 含量差别,凡是普通细胞的G1/ G0 期具备二倍体细胞的DNA含量(2N) ,而 G2/ M 期具备四倍体细胞的DNA 含量(4N) ,而S期的DNA 含量介于二倍体和四倍体之间。PI能够与DNA连系,其荧光强度间接反应了细胞内DNA含量。是以,经由过程流式细胞仪PI染色法对细胞内DNA含量停止检测时,能够将细胞周期各时相辨别为G1/G0 期,S 期和G2/M 期,取得的流式直方图对应的各细胞周期可经由过程特别软件计较各时相的细胞百分率(如图7.7所示)


图7.7流式周期检测图申明


手艺利用


检测异倍体的肿瘤细胞,检测药物、基因或卵白等对细胞周期的影响。


尝试流程




什物

数据信息

尝试周期

客户供给

细胞株(冻存株或培育细胞)及所需药品

细胞培育信息和药物处置体例

3周

咱们供给

残剩药品

根基尝试步骤、细胞培育照片、流式细胞仪的检测功效图、阐发后的数据和统计功效


尝试功效展现



G0/G1

S

G2/M

0h

58.06

40.30

1.64

24h

50.14

36.21

13.65

36h

40.20

29.57

30.23

48h

54.33

27.05

18.62


图1 流式细胞周期检测图


TROUBLESHOOTING

尝试题目

缘由

保举处置体例

TdR法双阻断后细胞未被有用阻断至G0/G1和S期?

待测细胞周期跨越30小时

该同步体例不合适细胞周期太长的细胞,需改用其余阻断体例。

收样时细胞量过少?

药物感化过强

下降药物浓度,削减处置时候,下降对细胞的凋亡感化。

周期尝试数据功效非常阿谁?

细胞接种密渡过大

构成发展非常

恰当下降细胞接种密度。













罕见题目FAQ


Q :流式上机检测细胞周期所须要的细胞量大要是几多?

A :周期检测普通接纳6孔板停止尝试,每孔细胞量10的6次方摆布。若是停止周期预尝试,则检测所须要的时候点较多,普通每隔12小时,须要取6个时间点,每一个时候点都须要留细胞样待测。须要的细胞量较大,务必经由过程细胞扩增获得所需尝试的细胞量。


Q :周期检测前对细胞同步化处置的目标和体例是?

A :因为群体中各个细胞处于差别的细胞周期时相之,为了研讨某临时相细胞的增殖、凋亡或基因表,须要使细胞处于细胞周期的同临时相,这便是细胞同步化手艺。同步化凡是有两种体例,血清饥饿法和药物阻断法。接纳血清饥饿法可获得GO期细,可接纳0.5%-1%小牛血清的培育基培育细胞48-72 h。接纳药物阻断法效力高,是今朝最首要的细胞同步化体例。对倍增时候低于30h的细胞,可接纳胸腺嘧啶核苷(TdR )双阻断法同步化,即持续2次处置靶细胞各24h,能够将99%细胞停滞在GO/G1和S期


Q :流式细胞仪PI染色法检测细胞周期前,细胞需做哪些处置?

A :细胞内的DNA和RNA都能够和PI连系,尝试前需用RNase将RNA消化后停止检测;因为PI不能经由过程细胞膜完全的细胞(如活细胞和初期凋亡细胞),在标本制备,必须先用终浓度70%乙醇或其余破膜剂加强细胞膜的通透性,才能使PI进入细胞内与细胞内的核酸连系


Q :除流式细胞仪PI染色法外,周期检测另有哪些常见的体例?

A :细胞周期的流式细胞仪PI染色法可精肯定量周期差别阶段的细胞比例,且体例操纵简洁。其余能够检测周期的体例另有1) Brdu (5-尿啶脱氧核苷)渗透法: BrdU是胸苷的一品种似物,插手培育基后,可做为细胞DNA复制的质料,接纳荧鲜明微镜或流式细胞仪停止检测,可定量研讨进入S期的细胞比例。2)利用单克隆抗体辨认细胞周期卵白并连系DNA含量阐发细胞周期:如在G1期初期cyclin D1抒发处于峰值, cyclin E峰值呈现在G1/S, cyclin A对应G2M, cyclin B1则可标示G2/M早期。此体例要注重周期卵白与各细胞周期的对应干系在差别品种的纳胞中并非都遵守。


参考文献

1. David Morgan.The Cell Cycle: Prnciples of Contrl [M]. New Science Pres 2006.

2. Teres S. Hawley.Robert G. Hawley Flow Cytometry Protocol[M] Humana Press.2004.

 
 
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